1 EVs的来源、分泌与提取
EVs是细胞释放到细胞外的膜结合型囊泡，能够在细胞间运输多种活性分子，逐渐成为细胞间通讯的重要介质。根据其大小和释放机制，分为凋亡小体（直径＞1000 nm）、微泡（直径100～1000 nm）和外泌体（直径＜150 nm）[2-3,9]。凋亡小体是在凋亡后期由垂死的细胞所释放；微泡由质膜外部的排泄或膜的直接出芽产生；而外泌体的形成过程主要包括：（1）细胞膜内陷形成早期核内体；（2）核内体分拣复合体调控早期核内体成熟，多个腔内小泡聚集于内泌体腔，腔内小泡不断积累形成多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs）；（3）MVBs成熟后与溶酶体融合以降解溶酶体，或与质膜融合释放腔内小泡到细胞表面形成外泌体，见图1 [12-13]。
分离动物来源EVs的主要方法有高速离心、梯度高速离心、超滤、共沉淀、尺寸排阻色谱法、场流分离法和免疫富集法等。尽管近年来研究者对P-EVs的研究逐渐深入，但仍未有标准化的分离方法。最常见的植物囊泡分离方法是差速离心结合高速离心法[14]。原材料的汁液经过几个不同的离心步骤：低速离心去除植物纤维和大颗粒、中速离心去除大的碎片和亚细胞器、高速离心获得P-EVs颗粒。然而，通过高速离心获得的P-EVs的类型、数量和质量可能受到离心力、转子类型、转子沉降角、溶液黏度等参数的影响，此外，由于高速离心也会沉淀其他囊泡、蛋白质和蛋白质/RNA聚集体，因此常与蔗糖密度梯度离心联用分离P-EVs与污染物。
通常用于分离纯化动物来源EVs的其他方法，如超滤或免疫磁珠法，尚未广泛用于P-EVs。但也有研究者使用一些新方法来分离纯化P-EVs，如使用外泌体纯化试剂盒，结合沉淀和尺寸排阻色谱法，成功从小麦中分离EVs [15]。Yang等[16]将电泳技术与相对分子质量3×10 5 的透析袋相结合成功从柠檬中分离出P-EVs。
2 EVs的生物学功能
近年来的研究表明，EVs携带丰富的脂质、蛋白质、DNA、RNA等，这些物质在脂质双分子层的保护下，可以相对稳定地存在于细胞外环境。因此，其不仅能作用于邻近细胞，还可以通过体液运输进入远端的靶细胞，发挥生理和病理信号载体的功能，实现细胞内/间物质传递与信息交流[17-18]。EVs参与许多重要的细胞过程，包括促进细胞侵袭、细胞生长、逃避免疫反应、刺激血管生成和耐药等，其所携带的DNA、mRNA等物质还与多种疾病的发病机制密切相关，因此有望被开发为用于癌症早期诊疗、检测疾病进展和指导个性化治疗的生物标志物[19]。
EVs的生物学功能与其供体细胞密切相关。不同细胞来源的EVs，如间充质干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cells，DCs）等释放的EVs，影响先天和适应性免疫系统中受体细胞的增殖和活性。DCs分泌的EVs（DCs-derived EVs，D-EVs），无论其是否成熟，在培养过程中都会促进辅助T细胞的应答反应产生γ-干扰素。Perez等[20]研究表明，D-EVs表面携带的MHC分子具有抗原递呈能力，参与免疫调节。此外，D-EVs也可作为抗癌药物的载体。从小鼠未成熟DCs中提取的EVs作为药物载体包载阿霉素，可抑制小鼠实体瘤生长，且无明显毒性[21]。巨噬细胞来源的EVs可以产生α-干扰素、γ-干扰素、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白细胞介素（interleukin，IL），促进CD4 +和CD8 +T 细胞的成熟，同时也可 调控巨噬细胞产生IL [22]。肿瘤细胞源性EVs具有肿瘤归巢特性，使其成为预防、诊断和治疗癌症的理想候选载体及诊断与监测肿瘤的生物标志物[23-25]。
P-EVs中提取分离出的脂质表明，P-EVs含有的2个主要脂质类别是磷脂和甘油。P-EVs富含脂质，包括磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等。不同来源的P-EVs中脂质的组成和含量不同。P-EVs作为一种药物载体，脂质对其功能发挥具有一定的影响，尤其是对靶向能力的影响。富含磷脂酸的姜来源EVs向鼠李糖乳杆菌发送信号时，被鼠李糖乳杆菌优先摄取，其含有的磷脂酸对肠道中EVs积累也有一定影响[24]。葡萄柚中的磷脂酰胆碱可促进其EVs被瘤胃球菌科吸收，增强EVs从肠道到肝脏的转移[26]。
除脂质外，P-EVs富含有大量的蛋白质。一些通道蛋白、酶蛋白和热休克蛋白（heat shock proteins，HSP）存在于P-EVs的膜表面或膜中。不同植物的P-EVs的蛋白质含量差异较大。拟南芥衍生EVs富含参与生物和非生物胁迫反应的蛋白质[27]。质谱分析表明，葡萄衍生P-EVs含有调节碳水化合物或脂质代谢的蛋白质和通道蛋白[28]。从生姜中提取的EVs含有少量蛋白质，主要是细胞质蛋白，包括肌动蛋白和蛋白水解酶。此外，还有一些与运输相关的膜蛋白[29]。虽然不同P-EVs的蛋白质并不完全相同，但在大多数P-EVs中仍然存在一些相同的蛋白质。如柑橘、姜和葡萄来源的P-EVs均含有网格蛋白重链、HSP和水通道蛋白等。此外，P-EVs还富含RNA，主要是microRNA（miRNA）。Xiao等[30]从11种可食用水果和蔬菜中（柑橘、豌豆、猕猴桃、哈密瓜等 ）分离出P-EVs，并对相应的miRNA文库进行Illumina测序，共鉴定出418种miRNA。靶点预测和功能分析表明，miRNA的高表达与炎症反应和肿瘤相关途径密切相关。
3 EVs作为药物递送载体的应用
3.1EVs作为药物递送载体的优势
EVs是细胞自身分泌的微小囊泡，参与细胞间物质与信息的交换，在健康保护和疾病治疗中具有重要作用，包括发育、免疫、维持组织稳态等过程及在癌症和中枢神经系统（central nervous system，CNS）疾病等治疗中。大量研究表明，EVs作为药物递送载体有着巨大的优势[19,31-35]。（1）EVs具有稳定性、较长的循环半衰期和良好的安全性，能够将药物以最小毒性的方式递送到靶细胞或靶组织。此外，EVs可以通过受体介导的内吞及巨胞饮等方式透过血脑屏障[11]。（2）EVs具有天然的靶向能力，不同细胞来源的EVs靠受体载体的相互作用和表面的黏附蛋白选择性靶向受体细胞，且EVs的粒径较 小，利用肿瘤部位的高通透性和滞留效应，可使其在肿瘤部位滞留，从而实现靶向性。与脂质体相比，二者的基本组分都是磷脂，但是EVs是由各种脂质和表面蛋白混合而成，其中一些成分有助于提高组织靶向性，其他成分则确保较小的非特异性相互作用[36-37]。且作为药物运输载体，EVs不仅发挥运输药物的功能，其本身及其所含有的内容物如mRNA和脂质等生物活性分子也会协同发挥治疗作用从而达到更好的治疗效果[38]。（3）EVs具有磷脂双分子层结构，可以包封疏水和亲水药物，显著提高包封率，改善某些RNA、化疗药物的稳定性差、溶解度差等问题[39]。EVs能够绕过补体因子的激活，从而保护其药物的有效载荷不被清除，即逃避免疫系统的识别和清除。因此，EVs作为一种天然的载体系统，具有免疫原性低、生物相容性高、靶向性强等特点，易跨越生理病理屏障，并在长期储存过程中保持高活性，使其成为一种理想的药物递送系统。
3.2EVs的载药方式
EVs载药包括对内源性和外源性药物的包载。内源性包载针对特定的细胞系，将药物与细胞共培养使所需的分子结合到EVs中。这种方式一般只用于细胞内可自然产生的蛋白质、核酸和小分子物质的包载，后续需要进一步分离纯化。内源性包载分为被动和主动载药，前者基于所需分子在细胞中的过表达，并依赖于这些分子在EVs中的被动捕获；后者基于细胞的分类识别机制，可以主动选择性地包载药物[32-33]。外源性药物多采用被动包载的方式，被动载药通常将药物或分子直接与EVs或EVs的供体细胞孵育。疏水性小分子可以通过共孵育方式被动进入外泌体脂质双分子层，且疏水性药物的浓度对载药效率起决定性作用。但由于其非靶向性，可能会导致EVs产量低、载药量有限。常见的提高载药效率的主动载药方式有电穿孔、超声、挤压、冻融循环等。此外，还可以通过膜通透性剂和表面活性剂（如皂苷）与EVs膜中的胆固醇相互作用形成孔隙，以增加载药效率，然而皂苷的溶血作用可能限制其应用[34-35,40-42]。不同载药方式的优缺点总结见表1。
4 EVs在中药组分递送中的应用
EVs可作为靶向纳米平台用于药物递送治疗多种疾病[25]。利用EVs来源的生物标志物进行疾病的检测，是一种准确、无创且效益高的诊断方法。EVs表面的肿瘤特异性抗原具有良好的抗原免疫原性，已被用于开发癌症疫苗和生产单克隆抗体。EVs的脂质双分子层允许疏水性和亲水性药物的负载，实现高效递送[39,44]。
4.1 肿瘤相关疾病
姜黄素是中药温郁金的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化应激和抑制恶性肿瘤细胞增殖的作用。Osterman等[45-46]研究表明，在姜黄素处理的胰腺癌细胞分离的外泌体中已被证明有姜黄素的存在。姜黄素可通过外泌体递送到受体胰腺癌细胞，下调与癌症进展相关的转录因子，包括核因子-κB和信号转导和转录激活因子3，导致下游生存靶点的消耗，促进细胞毒性，降低细胞活力，降低凋亡抑制剂（inhibitor of apoptosis，IAP）存活素、cIAP1、cIAP2和XIAP在胰腺癌细胞的蛋白和mRNA水平上诱导凋亡细胞死亡。
雷公藤内酯（triptolide，TP）是雷公藤的主要活性成分。具有免疫抑制、抗炎、抗肿瘤等活性，在体外可以抑制各类癌细胞的增殖，抑制实体瘤在体内的生长和转移。但TP溶解性较差，而且可能导致严重的生殖系统、肝和肾毒性[47-49]，阻碍TP在卵巢癌治疗中的潜在临床应用。Liu等[50]通过高速离心和超滤离心收集人卵巢癌SKOV3细胞-外泌体（SKOV3-exosomes，SK-Exos），构建负载雷公藤内酯的外泌体递送系统Exos-TP，其负载率较高、可将药物有效地递送至靶细胞并减弱TP的毒性。喜树碱作为一种可逆的拓扑异构酶抑制剂，可限制DNA的合成，但由于其不溶于水和较强的毒副作用，限制了其临床使用。Malhotra等[51]使用红细胞膜来源的囊泡，负载疏水性药物喜树碱，其稳定性和基本结构特征保持不变，且具有较高包封率，24 h内喜树碱表现出较慢的释放和较强的保留。
纳米EVs不容易被巨噬细胞吞噬，因此具有更长的循环时间且不被宿主免疫系统所识别。该体系对喜树碱和CM-DiI在24 h内分别表现出较慢的释放和较强的保留；EVs被人肺癌A549细胞内化后，可诱导肺癌细胞凋亡，毒性略高于游离喜树碱；在体内有应用潜力，在血液中的滞留率超过48 h。
化疗药物紫杉醇也可被EVs包载显著提高其治疗效果。Zhu等[52]通过高速离心法从胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）分离外泌体ESC-Exos，制备了带有巯基的RGD环肽修饰和紫杉醇负载的ESC-Exos（cRGD-Exos-PTX），cRGD-Exos-PTX可通过增强靶向性显著提高紫杉醇治疗胶质瘤的疗效。将紫杉醇和吉西他滨单磷酸负载于骨髓间充质干细胞来源的外泌体内，可以增加药物在肿瘤部位的聚集能力，克服胰腺导管腺癌的耐药性，产生良好的体内外抗癌效果。
4.2 CNS疾病
中药及其有效成分可作为治疗CNS疾病的潜在新药。Zhang等[53]发现石菖蒲挥发油可降低α-突触核蛋白水平并抑制自噬激活治疗帕金森病（Parkinson’s disease，PD）。在慢性不可预测应激动物模型中，人参皂苷Rg 3 （ginsenoside Rg 3 ，Rg 3 ）可通过减少促肾上腺皮质激素释放激素、皮质酮和促肾上腺皮质激素的产生，抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴过度激活，从而发挥抗焦虑和抗抑郁作用[54]。内源性神经干细胞的激活可以实现梗死神经元的替换，促进神经网络的再生，Rg 1 、黄芪甲苷、淫鼠藿苷、丹酚酸B、白藜芦醇、姜黄素、青蒿琥酯和银杏内酯B可通过不同的信号通路和分子激活内源性神经干细胞[55]。阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的CNS疾病，发病原因可能是脑实质和血管中的β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）积累导致血管完整性受损和清除受损。使用小鼠脑神经瘤Neuro-2A细胞来源的外泌体分别包封5种潜在的神经保护天然化合物黄芩苷（baicalin，BA）、常春藤皂苷元（hederagenin，Hed）、甲基莲心碱（neferine，Nef）、Rg 3 和雷帕霉素（rapamycin，Rapa），分别得到化合物Exos-BA、Exos-Hed、Exos-Nef、Exos-Rg 3 和Exos-Rapa，可增强其透过血脑屏障的渗透性，且有更高的生物有效性[56]。与单独化合物相比，Exos-BA、Exos-Hed和Exos-Nef可降低突变蛋白HTT74、P301L tau和A53T α-突触核蛋白的水平，促进突变蛋白在细胞中的自噬降解。此外，Exos-Nef可改善淀粉样前体蛋白/早老素基因1双转基因小鼠的运动协调的程度，降低原纤维化Aβ水平。槲皮素（quercetin，Que）在治疗AD时，可通过改善认知功能，预防tau蛋白病理变化，诱导神经保护作用。然而，由于其脑靶向性和生物利用度较差，临床应用受到限制。Qi等[57]用血浆外泌体包载槲皮素Exos-Que，可改善槲皮素的脑靶向性，并显著提高槲皮素的生物利用度。此外，与游离槲皮素相比，Exos-Que通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶介导的tau磷酸化和减少不溶性神经纤维缠结的形成，从而更好地缓解AD的症状，显示其治疗AD的潜力。有研究表明水飞蓟素（silibinin，Slb）在降低Aβ聚集和使星形胶质细胞失活，改善AD患者的行为和认知方面具有双重治疗作用。Huo等[58]将Slb包裹在Mφ源性外泌体（Exos-Slb）中，当该复合物进入大脑后，Exos-Slb可选择性地与Aβ单体相互作用，并减少其聚集。同时，Exos-Slb在星形胶质细胞中被内化，抑制其激活，减轻星形胶质细胞炎症介导的神经元损伤，进而改善AD小鼠的认知缺陷。
表儿茶素没食子酸盐（epicatechin gallate，ECG）是药效最好的儿茶素成分之一，在体内外对神经元都具有良好的神经保护作用，减少AD和PD的发生。然而由于ECG稳定性和肠道渗透性较差，可能影响体内循环期间的生物利用度。Luo等[59]设计了一种新的基于Exos的ECG递送系统，从新鲜牛乳中分离得到Exos，采用超声法将ECG包载于EVs中，得到Exos-ECG，其人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞具有神经保护作用。BA是一种强大的自由基清除剂，在缺血性脑卒中的治疗中可发挥神经保护作用。但由于其不能靶向脑组织、溶解性差，使得临床应用受到限制。Huang等[60]设计的Exos-BA在短暂性大脑中动脉闭塞/再灌注模型和永久性大脑中动脉闭塞模型中，Exos-BA比游离BA表现出更好的脑靶向性。Exos-BA可显著减少活性氧的生成，提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。改善BA在动物模型大脑中的溶解度和积累，减少脑梗死体积、减轻神经功能缺损程度、提高神经元存活率，并激活了神经元中的核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1通路，从而显著减轻卒中模型中的脑缺血损伤。
4.3 炎症
脂多糖诱导的脓毒性休克的特征之一是隔离在肺部的CD11b +Gr-1 +细胞数量的急剧增加，导致急性肺部炎症。姜黄素与外泌体复合物治疗的小鼠对脂多糖诱导的感染性休克具有保护作用，且可以降低炎症因子IL-6和TNF-α的水平[61]。姜黄素与外泌体复合物可减少小鼠肺中CD11b + Gr-1 + 细胞数量，增加姜黄素向激活的单核细胞的传递，从而增强其抗炎活性。
5 P-EVs的生物活性与作为载体的应用
除了蛋白质、核酸、脂质和其他常见成分外，P-EVs中还包括植物特有的活性成分。在作为载体进行运输时，可实现活性成分的共同运输。如从人参中分离并鉴定的一种新型人参EVs样纳米粒（ginseng-derived nanoparticles，GDNPs），通过电喷雾离子化扫描检测到GDNPs中Rg 3 的含量较高[62]。GDNPs作为一种免疫增强剂显著促进巨噬细胞M 2 向M 1 表型的极化，产生活性氧，导致小鼠黑色素瘤细胞凋亡增加，抑制荷瘤小鼠黑色素瘤的生长。GDNPs诱导的M 1 极化依赖于Toll样受体4和髓系分化抗原88介导的信号传导；GDNPs的神经酰胺脂质和蛋白质可能通过Toll样受体4的激活在巨噬细胞极化中发挥重要作用。Man等[63]通过研究姜来源P-EVs的活性成分，发现姜来源的EVs中含有6-姜辣素、8-姜辣素和10-姜辣素等，这些姜辣素可以从囊泡输送到大鼠的肠道并被吸收，不同肠道吸收趋势为十二指肠＞空肠＞回肠。表明姜来源EVs具有良好的载药性能，作为药物传递系统的载体具有重要的应用前景。同时，结合3种姜酚化合物的油水分配系数，推测姜来源EVs的负载量与其脂溶性呈正相关。Perut等[64]从草莓中提取的EVs中检测到丰富的维生素C，且显示出强烈的抗氧化作用。
芦丁是一种类黄酮植物化学成分，可以清除活性氧，减少促炎因子的产生[65]。已有研究证明在脊髓损伤的大鼠模型中芦丁可以通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶和减轻氧化应激，减轻脊髓损伤[66]。然而，低溶解度、低生物利用度和快速清除限制了其应用。从槐米浸出液中提取得到含有芦丁的槐米来源的外泌体（Flos Sophorae Immaturusderived exosomes，so-Exos），将so-Exos封装在聚多巴胺修饰的水凝胶中，构建了用于脊髓损伤治疗的局部植入系统，并通过高效液相色谱证明so-Exos中芦丁的存在[67]。外泌体的持续释放可以改善周围有害的活性氧微环境：（1）在低氧条件下，改善细胞损伤；（2）外泌体可被神经细胞内化，刺激其再生，促进其对氧化损伤的耐受性；（3）实现脊髓损伤后神经再生和运动功能的快速恢复，显著改善运动系统；（4）降低大鼠脊髓横断后并发症——尿潴留程度。
基于目前的研究，运输的药物多为化学药，因此需要大量研究来探索P-EVs在运输中药组分方面的应用。从葡萄、葡萄柚、生姜和胡萝卜来源提取的纳米粒还具有抗癌特性。葡萄柚是一种用于纳米药物的递送的植物性食物来源。Wang等[68]研究表明，葡萄柚衍生纳米载体在递送治疗剂方面疗效显著，从葡萄柚来源的EVs中提取脂质并用叶酸进行修饰制备工程脂质载体，该载体可以携带化学药、蛋白质和核酸等。且该工程化脂质载体具有体内靶向特异性，且安全性良好。此外，将甲氨蝶呤加载到葡萄柚衍生EVs中可以减少甲氨蝶呤的不良反应并增强抗结肠炎的作用。Niu等[69]将载有阿霉素的肝素基纳米颗粒偶联到葡萄柚衍生的EVs表面，基于EVs上各种细胞膜蛋白质的存在，可以穿过血脑屏障，达到治疗胶质瘤的目的。
生姜是使用最广泛的天然产品之一，具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌等作用。Zhang等[70]从生姜中分离脂质并重组制备大量姜衍生纳米粒（ginger- derived nanovectors，GDNVs），且发现GDNVs可被肠癌细胞有效吸收，高效负载阿霉素后通过靶向叶酸配体实现对结肠癌的积极靶向。表明GDNVs在药物载体方面的巨大潜力，有望开发为一种新的口服给药系统。Zhang等[71]研究表明，GDNVs被巨噬细胞和肠上皮细胞摄取后能够维持肠道内稳态，增加抗炎细胞因子IL-10和IL-12表达，降低促炎因子IL-6、TNF-α等表达。且在不同的小鼠结肠炎模型，GDNVs可减少急性结肠炎，增加肠道修复，并抑制慢性结肠炎和结肠炎。
6 结语与展望
EVs由于其高生物相容性、低免疫原性及易通过生理屏障等特点，越来越多地被用于中药组分的体内递送。尽管EVs在药物递送与疾病治疗方面具有广泛的应用前景，但仍有一些问题。（1）EVs作为生物标志物，对其灵敏而特异的检测仍有待研究。（2）开发更为高效、便捷的EVs分离技术以获得高纯度的外泌体仍是一大难题。EVs的分离技术繁琐，且获得的EVs具有异质性，在大小、相对分子质量等特性间的差异影响EVs的治疗性能。分离得到的EVs整体组成和囊泡内容物的成分组成和作用机制尚未完全清楚，导致EVs难以应用于临床。且保持EVs完整性的最佳储存条件（如温度或pH值）较为苛刻。（3）作为药物靶向载体，优化出更为高效的药物加载方式是保证治疗成功的关键所在[36]。P-EVs具有来源广泛、产量大和安全性高等优势，但是目前关于P-EVs作为治疗剂和载体的研究较少，关于P-EVs及其所携带的RNA、蛋白质等成分发挥作用的机制尚不明确。综上所述，进一步了解与开发EVs作为中药组分递送载体在疾病中的应用可为临床应用提供参考。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：王若宁，张迎洁，王笑红，朱安然，狄留庆． 不同来源细胞外囊泡在中药组分高效递送领域中应用的研究进展 [J]. 中草药, 2023, 54(14):4672-4681.返回搜狐，查看更多